Similarità e allineamento fra sequenze

L'allineamento di sequenze è il processo di appaiamento delle regioni simili condivise da due sequenze. Il nostro scopo è quello di associare ad ogni nuova sequenza una o più specifiche funzioni.
Lo scopo dell’allineamento di sequenze è quello di permettere al ricercatore di determinare se le sequenze da comparare dimostrano sufficiente somiglianza ( similarità ) per giustificare l’inferenza di omologia.
Si dicono omologhe quelle sequenze che hanno un gene ancestrale comune ovvero che condividono un progenitore. Il grado di similarità fra due sequenze può essere misurato, l'omologia è un dato qualitativo. La similarità di due sequenze è una quantità misurabile che può essere espressa come, per esempio, percentuale di identità. Il fine di tale operazione e di sfruttare il principio secondo il quale sequenze omologhe spesso, ma non sempre, hanno funzioni comuni.

Si possono produrre due tipologie di allineamento, uno globale che prevede l'allineamento delle sequenze secondo la loro intera lunghezza, ed uno locale che non richiede che il confronto delle due sequenze sia svolto per l' intera lunghezza delle sequenze. Spesso si trova che alcune regioni di una proteina, o alcuni specifici aminoacidi, sono piu’ conservati di altri; questa informazione può essere indicativa dei residui che sono piu’ importanti per il mantenimento della struttura o della funzione. Se però partiamo da organismi strettamente correlati, come il topo ed il ratto, queste similarità possono essere semplicemente indicative del fatto che una determinata regione non ha avuto ancora il tempo di divergere. I metodi di allineamento globale non tengono in considerazione questo fatto, e’ allora meglio utilizzare un sistema di allineamento che possa produrre un allineamento locale.

La figura mostra graficamente la differenza tra l'allineamento locale e l'allineamento globale

La prima semplice misura di similarità è data dalla somma del numero di appaiamenti di caratteri nelle due sequenze ( caratteri uguali nella stessa posizione nelle due sequenze ) .

Esempio :

Le due sequenze sopra riportate si appaiano esattamente per 22 nucleotidi ( rappresentati dai caratteri nelle sequenze ), quindi la similarità tra queste due sequenze è pari a 22.
Per questo esempio il miglior allineamento tra le due sequenze è quello mostrato. Ma non è sempre così semplice, spesso è necessario generare tutti i possibili allineamenti tra due sequenze per poter poi valutare quale sia l’allineamento migliore. Un buon metodo per generare tutti i possibili allineamenti tra due sequenze consiste nel fare scorrere una delle due sequenze rispetto all’altra e nel valutare la similarità di sequenza (il punteggio ottenuto) di ognuno degli allineamenti generati.

Si definisce la similarità di sequenza come il più alto dei punteggi ottenuti.

In generale, per confrontare due sequenze di lunghezza, rispettivamente m ed n, il numero degli allineamenti generati N è pari alla somma della lunghezza delle sequenze meno 1 :

N = m + n - 1
L’allineamento associato alla più alta misura di similarità verrà scelto come il migliore degli allineamenti possibili.

Il numero dei confronti C tra caratteri effettuati, è invece pari al prodotto delle due lunghezze :
C = m x n

L'esempio riportato nella figura sottostante stigmatizza l'elevato numero di confronti necessari ( evidenziati all'interno dei rettangoli ) per calcolare la similarità di sequenza anche con sequenze molto brevi, inoltre nell'esempio non si tiene conto della possibilità di introdurre gaps ( inserzioni, cancellazioni ) in una delle due sequenze, cosa che aumenterebbe ancor più il numero di operazioni necessarie per il calcolo della similarità.

Quando si deve effettuare una ricerca per similarità di sequenza in una banca dati, l’operazione di confronto tra due sequenze deve inoltre essere ripetuta per ogni coppia di sequenze:

1) sequenza in input (query sequence) ;
2) ognuna delle sequenze della banca dati .

Tutto questo senza considerare le ulteriori complicazioni legate alla possibile presenza di gaps nell’allineamento tra due sequenze. Come mostra l'esempio di seguito, vi è necessità di trattare l’inserimento o la cancellazione di caratteri nell'allineamento (gaps), in quanto tale procedura ci porta generalmente ad allineamenti con punteggi più elevati.

L’apertura di un gap in una struttura proteica comporta uno stress che in realtà dipende soprattutto dalla regione strutturale in cui avviene l’inserimento o la delezione. Inserzioni e cancellazioni sono fortemente penalizzate all’interno delle regioni di struttura secondaria (α-eliche e filamenti β), in quanto costringono alla modifica delle interazioni con le strutture secondarie circostanti. Inoltre l’apertura di un gap non può venire penalizzata con un punteggio negativo come ogni sua estensione, infatti una volta che la sequenza abbia accettato una inserzione o una cancellazione, la penalizzazione non deve essere necessariamente legata alla sua lunghezza.

Esempio:
Se la penalizzazione che imponiamo per l’apertura di un gap fosse il punteggio negativo -1, non vorremmo che l’inserzione di un residuo all’interno di un loop fosse penalizzata di un punto e quella di 5 residui nella stessa posizione fosse penalizzata di 5 punti.
E' noto infatti che esistono diversi casi in cui ci possono essere inserzioni più o meno lunghe in posizioni corrispondenti di un loop (vedi il caso dei loops ipervariabili degli anticorpi) .

Un algoritmo di allineamento che tenga conto del possibile inserimento di un gap in ogni possibile posizione delle due sequenze e di ogni possibile lunghezza di un gap in ogni possibile posizione sarebbe estremamente lento.
Gli allineamenti e il calcolo della similarità potrebbero essere notevolmente migliorati dall’introduzione di schemi di punteggio diversi da 0 e da 1 per l’appaiamento di residui amminoacidici; ad esempio si potrebbero prevedere punteggi alti per l’identità tra coppie di residui, punteggi un po’ più bassi ma maggiori di 0 per residui simili dal punto di vista chimico-fisico, punteggi invece negativi (o uguali a 0) per residui diversi o molto diversi dal punto di vista chimico-fisico. Sarebbe quindi utile definire una matrice di sostituzione ovvero una tabella che associ un valore ad ogni coppia di caratteri.

Es.

Nella figura sottostante vengono allineate le sequenze AAKKQW e AAKQW, nella riga fra le due sequenze vengono riportati i punteggi relativi agli accoppiamenti (A nessun carattere, AA, KA, KK, QQ, WW ) provenienti dalla matrice di sostituzione PAM 10, la somma di questi ( pari a 3 ) è il punteggio di similarità dell'accoppiamento.

Gli allineamenti, inoltre, possono essere visualizzati graficamente con matrici di punti (dot matrices). Si considera una matrice bidimensionale in cui la prima righa corrisponde alla prima sequenza scritta da destra verso sinistra, mentre la prima colonna corrisponde alla seconda sequenza ordinata dall'alto verso il basso. In ogni punto in cui la sequenza nella riga e nella colonna coincidono, introduciamo un asterisco nel grafico. Le regioni delle sequenze che possono essere allineate senza introdurre gap emergono come una serie contigua di punti sulla diagonale, i gaps appaiono come ‘salti di diagonale’. Il rumore di fondo é molto alto perché molti dei match tra sequenze costruiti in questo modo sono casuali e dipendono da singole occorrenze dello stesso residuo in posizioni diverse delle due sequenze. La figura qui riportata mostra un esempio di tale tecnica di allineamento ( con diversi livelli di approfondimento visuale ).

Quindi per effettuare un allineamento è prima di tutto necessario scegliere una matrice di sostituzione per valutare gli appaiamenti tra residui e definire dei punteggi di penalizzazione per i gaps, ci si può inoltre avvalere di algoritmi di allineamento che utilizzano una tecnica di programmazione dinamica come quello di Needleman e Wunsch (1970)[1], oppure quello di Smith e Waterman (1981)[2].

[1] Temple F. Smith and Michael S. Waterman ( 1981 ). Identification of Common Molecular Subsequences, J. Mol. Biol., 147:195-197.

[2] Needleman, S. B. & Wunsch, C. D. ( 1970 ). A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J.Mol. Biol. 48, 443- 453.